پایان نامه کلونینگ و بیان ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز باکتری E. coli جهش یافته و مقایسۀ خواص این آنزیم با نوع native آن

ارسال شده در سایت پایان نامه

فهرست

چکیده …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 1

مقدمه ………………………………………………………………………………………………………………………………………..3

فصل اول کلیات …………………………………………………………………………………………………….. 5

1-1-پیشینه تاریخی ………………………………………………………………………………………………………………….. 6

1-2-آماده سازی ال-آسپاراژیناز قابل استفاده برای درمان ……………………………………………………………… 8

1-3-  آزمایش های بالینی با ال-آسپاراژیناز ……………………………………………………………………………….. 10

1-4-خصوصیات شیمیایی و داروشناسی این دارو ………………………………………………………………………. 12

1-4-1  اثر ضد سرطانی ………………………………………………………………………………………………………….. 12

1-4-2- ترکیبات شیمیایی داروی در دسترس برای درمان …………………………………………………………… 14

1-4-2-1 آنزیم طبیعی ……………………………………………………………………………………………………………. 14

1-4-2-2-آنزیم تغییریافته ………………………………………………………………………………………………………. 16

1-5- فارماکوکنتیک ……………………………………………………………………………………………………………….. 19

1-5-1- مقاومت دارویی ………………………………………………………………………………………………………… 23

1-5-2-  تأثیر دارویی ………………………………………………………………………………………………………….. 25

1-6-سمیّت ………………………………………………………………………………………………………………………… 28

فصل دوم روش کار …………………………………………………………………………………………… 34

2-1- مواد و میکروارگانیسم ها ……………………………………………………………………………………………….35

2-2- کشت باکتری ……………………………………………………………………………………………………………… 35

2-3- اعمالUV  در زمان های مختلف …………………………………………………………………………………… 35

2-4- انجام تست Nesslerization به منظور بررسی مقدار آمونیاک آزاد شده ..……………………….. 36

2-4-1- کشت کلنی ها ……………………………………………………………………………………………………….. 36

2-4-2- تعیین غلظت آمونیاک آزاد شده در محلول واکنش توسط ال-آسپاراژیناز کلنی ها …………… 37

2-4-3- محلول های لازم برای سنجش میزان فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز کلنی ها ……………………. 38

2-5- استخراج  DNA…………………………………………………………………………………………………………. 40

2-5-1- کشت باکتری به منظور استخراج  DNA…………………………………………………………………….. 40

2-5-2- استخراج DNA ژنومی ……………………………………………………………………………………………. 41

2-6- واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR)   ………………………………………………………………………………. 42

2-7- الکتروفورز بر روی ژل آگارز ……………………………………………………………………………………. 43

2-8- خالص سازی محصول PCR …………………………………………………………………………………….. 44

2-9- استخراج پلاسمید ……………………………………………………………………………………………………. 46

2-10- هضم آنزیمی و کلون کردن قطعه در داخل وکتور ……………………………………………………… 47

2-10-1- الگوی برش آنزیمی ژن ال-آسپاراژیناز ll …………………………………………………………….. 47

2-10-2- برش و آماده سازی وکتور pET23a(+) ……………………………………………………………… 48

2-10-3- واکنش الحاق وکتور pET23a(+) با قطعه ژنی ال-آسپاراژینازll  ……………………………. 48

2-11-ایجاد سلول های Competant و انتقال پلاسمید …………………………………………………….. 49

2-12-انتخاب کلون های مثبت …………………………………………………………………………………………. 50

2-13- تأیید کلنی های نوترکیب با PCR و هضم آنزیمی …………………………………………………….. 51

2-13-1-PCR ……………………………………………………………………………………………………………….. 51

2-13-2- هضم آنزیمی ……………………………………………………………………………………………………. 52

2-14- بیان و استخراج پروتئین بیان شونده توسط ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll …………………………. 53

2-14-1- القاء بیان پروتئین آنزیمی ال-آسپاراژیناز  ll…………………………………………………………… 53

2-14-2- استخراج پروتئین های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll  و ال-آسپاراژیناز l ………………………… 54

2-15- بررسی اولیه بیان پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز ll و پروتئین ال-آسپاراژیناز l با SDS-

PAGE  …………………………………………………………………………………………………………………………… 55

2-16- تعیین فعالیت آنزیمی یا فعالیت کلّی( IU ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز  …………………………. 58

2-17- تعیین پروتئین کلّی ( mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ……………………………………………….. 59

2-18- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg )  آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ………………………………………….. 62

2-19- کشت سلول انسانی  ………………………………………………………………………………………………. 62

2-19-1- تهیه محیط کشت RPMI1640 ………………………………………………………………………. 63

2-20- تاثیر آنزیم ال-آسپاراژیناز ll (نوترکیب)،ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های

سرطانی انسانی  ………………………………………………………………………………………………………………. 63

2-20-1- MTT Assay …………………………………………………………………………………………………. 63

2-21- تست تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT …………………… 65

فصل سوم نتایج …………………………………………………………………………………………….. 67

3-1- بررسی و شماره گذاری کلنی ها ………………………………………………………………………………. 68

3-2- نتایج اعداد جذب محلول های استاندارد سولفات آمونیوم در طول موج nm490 …………… 69

3-3- بررسی اعداد جذب آمونیاک آزاد شده در محلول های به دست آمده از کلنی های جهش

یافته ……………………………………………………………………………………………………………………………… 70

3-4- جداسازی و تکثیر ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll  ……………………………………………………………. 72

3-5- تعیین توالی قطعه ژنی l-aspsraginase ll  …………………………………………………………….. 74

3-6- وارد کردن قطعه ژنی l-asparaginase ll  در وکتور pET23a و تأیید آن …………………. 76

3-7- نتیجه SDS-PAGE نمونه های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll , l و استاندارد …………………………

برای دانلود پایان نامه اینجا کلیک کنید

 

مطالب مشابه را هم ببینید

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید !

سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه ، تحقیق ، پروژه و مقالات دانشگاهی در رشته های مختلف است. مطالب مشابه را هم ببینید یا اینکه برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید

پایان نامه پیشنهاد و ارزیابی یک سیستم جداساز لرزه ­ای جدید و کاربردی
پایان نامه ارشد تحولات کیفرشناختی در قانون مجازات جدید
پایان نامه میزان توجه به مؤلفه ی مسئولیت پذیری برای اعمال شخصی و اجتماعی در برنامه درسی دوره ابتدایی
پایان نامه تعیین رابطه الگوی ارتباط توقع مرد-کناره گیری زن والدین با سازگاری اجتماعی کودکان
پایان نامه ارشد رشته روانشناسی دوران بارداری